轉染（Transfection） ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。

轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。

一

轉染的類型

1）根據導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉和穩轉。

2）根據轉染方式可以分為化學，生物，物理方法。

脂質體轉染法簡單快捷且不需要其他儀器輔助的綜合考慮，一般是實驗室的常客，所以接下來先給大家介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟。

二

脂質體轉染法

脂質體(Liposome)轉染方法原理

脂質體作為體內和體外輸送載體的工具，已經研究的十分廣泛，中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。

優點:

與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性，它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。

脂質體轉染操作步驟

進行實驗之前，請先規劃好實驗，一般細胞轉染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質體和DNA的儲備量，并確認準備好所需試劑：Opti-MEM無血清培養基，Lipofectamine轉染試劑，以及DNA，這個一定要確認好。

1、細胞鋪板

（1）一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次（匯合率達到90%之前對細胞進行傳代，不要長到100%），從解凍過程中恢復過來可以穩定生長的細胞進行細胞轉染，傳代次數高(>30-40)時，細胞的生長速度和形態會改變。

（2）如果提總蛋白，一般選擇六孔板進行轉染，因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。

（3）傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)。

（4）轉染當天，將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降，如果是簡單細胞系的轉染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉染。轉染時，細胞密度會影響轉染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%（這個前提是轉染24h，如果轉染48h則需要匯合率為50-70%），細胞的鋪板和轉染也可同時進行。

2、細胞轉染

吸去培養皿中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。更換無血清培養基。準備轉染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒；B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉染試劑到每個孔的培養基中，6h后，更換成完全培養基，繼續培養到24-48小時（不同的質粒和脂質體最佳搭配比例不同，轉染前，應該摸一個最佳配比。質粒：脂質體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例，一般質粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率）。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。

轉染時，應使用優質質粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度，測得的OD值應介于1.7-1.9之間。脂質體轉染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。

2、含有內毒素的質粒對細胞有很大的毒性作用。

轉染時，小心輕柔的將lipo2000加到培養基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質體失效。

血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞會受到損傷，甚至死亡（比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞）導致轉染效率極低。不過轉染產品配方幾經革新后的今天，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，但是血清的存在會影響DNA-轉染復合物的形成，在DNA-轉染復合物形成時需用無血清培養基opti-MEM來稀釋DNA和轉染試劑，在轉染過程中是可以使用血清的。轉染后6小時更換培養基，因為lipo2000具有一定毒性。

細胞培養過程中往往會添加抗生素來預防污染，但是抗生素可能對轉染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預防污染的抗生素，就會影響轉染，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒，但當轉染試劑增加了細胞的通透性時，就會使抗生素也進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。目前轉染試劑有些已經可以全程都用有血清和抗生素的完全培養基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。

3、觀察轉染的效果

在轉染后24小時，用熒光顯微鏡觀察實驗結果并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉染成功，且轉染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來對照，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質粒共轉染，同時用Q-PCR和者WB來檢測。

轉染后發現轉染效率不高，可以通過兩種方法：

1、復轉染，即轉染后12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染后細胞死亡數較少。

2、通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。

未完待續