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如何分離純化、鑒定外泌體

所屬分類：技術(shù)文章發(fā)布時(shí)間：2021-09-29

外泌體的分離純化、鑒定（如何分離純化、鑒定外泌體）

外泌體是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。
所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關(guān)他們分泌和攝取及其組成、“運(yùn)載物”和相應(yīng)功能的精確分子機(jī)制剛剛開(kāi)始研究。外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊，對(duì)外泌體的研究興趣日益增長(zhǎng)，無(wú)論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng)診斷的開(kāi)發(fā)。

一、分離:
超速離心法:
超速離心法是外泌體分離最常見(jiàn)的技術(shù)之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有1/2的研究者會(huì)選擇該種方式分離外泌體。該方法由幾個(gè)離心步驟組成，可分步去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡，沉淀外泌體（如圖所示）。但該種方法用于血漿和血清等粘性生物液體時(shí)效率較低，且重復(fù)離心操作有可能對(duì)外泌體造成損害，從而降低其質(zhì)量。

如將超速離心配合蔗糖溶液進(jìn)行梯度密度離心可得到純度更高的外泌體，是公認(rèn)可以得到最高純度的分離方法。但此法對(duì)離心時(shí)間非常敏感，一般需要8-30h，產(chǎn)率較低，同樣不適用于血漿和血清等粘性生物液體中外泌體的分離，因此難以廣泛普及。

聚合物沉淀法:
第二大主流的外泌體分離技術(shù)就是基于聚合物的沉淀法了，最常見(jiàn)的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常將含有聚合物的沉淀溶液與生物體液混合，4℃溫育，低速離心，沉淀外泌體（如圖所示）。目前已有成熟的PEG-base商業(yè)試劑盒，比如圖中的ExoQuick?（System Biosciences）。這類試劑盒使用容易和快速，不需要額外的設(shè)備，且隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開(kāi)來(lái)。沉淀法的主要缺點(diǎn)是分離物中會(huì)有少量的聚合物存在。不過(guò)大家不用擔(dān)心，一般來(lái)說(shuō)這些物質(zhì)不會(huì)干擾下游分析，使用商業(yè)試劑盒提取外泌體也受到越來(lái)越多雜志的認(rèn)可。

二、鑒定
外泌體的鑒定是繼分離后又一個(gè)困擾研究者的問(wèn)題。如果大家看過(guò)外泌體研究相關(guān)的文獻(xiàn)，就肯定對(duì)一張圖印象深刻。

不錯(cuò)，想發(fā)外泌體文章，光找到高效率的分離方法還不夠，要過(guò)的第二關(guān)就是證明你分離得到的就是外泌體。

鑒定方式不外乎就是下面這三種：1. 形態(tài)學(xué)（電鏡）；2. 粒子大小（徑粒分析）；3. 標(biāo)志蛋白（WB）。

綜合來(lái)說(shuō)，透射電鏡可以清楚的看到外泌體的大小、形態(tài)等，屬于鑒定方法中的金標(biāo)準(zhǔn)，其他兩種方式則常常作為輔助使用。

三、得到了外泌體之后如何做？
外泌體攜帶大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特異性的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子）等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)。對(duì)外泌體驗(yàn)明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和深入分析了。

由于外泌體中含有較多降解的短RNA片段，測(cè)序時(shí)會(huì)成為背景干擾有效數(shù)據(jù)，通常都建議使用芯片的方法檢測(cè)外泌體miRNA。而對(duì)于lncRNA來(lái)說(shuō)，大部分在細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，在外泌體中豐度就更低了，對(duì)于低豐度基因，芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于測(cè)序，因此也建議使用基因芯片的方法檢測(cè)外泌體lncRNA。