WB常用試劑配方
1.WB樣本制備相關試劑
做WB時，我們第一步就是要獲得待測蛋白樣本，這里我們一般會用到樣本裂解液（Lysis Buffer）。
蛋白裂解液包含以下幾個組份：緩沖系統、鹽離子、離液劑、還原劑和蛋白酶抑制劑。其中蛋白酶抑制劑種類繁多，可根據實驗需求挑選合適品類。
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類別 |
試劑 |
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金屬蛋白酶抑制劑 |
EDTA-2Na、EGTA-2Na等 |
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磷酸酶抑制劑 |
原釩酸鈉、焦磷酸鈉、 β-甘油磷酸鈉、氟化鈉等 |
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絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶抑制劑 |
PMSF |
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氨基肽酶抑制劑 |
bestatin |
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天冬氨酸蛋白酶抑制劑 |
pepstatin A |
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半胱氨酸蛋白酶抑制劑 |
E64 |
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說明 |
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1.原釩酸鈉需要經過激活才能有效發揮抑制作用（調pH值至10左右，然后加熱至無色，冷卻后再調pH值至10，如此反復至pH值穩定在10即可）。 2.PMSF劇毒，在水溶液中不穩定，所以PMSF都是在有機試劑、異丙醇、DMSO中溶解的。 |
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▲ 蛋白酶抑制劑類型
RIPA裂解液（RIPA buffer）是一種傳統的細胞組織快速裂解液，通常用來作為WB提取蛋白首選裂解液。
并且生產測試過程中，我們研發人員也對傳統的RIPA裂解液做了一些改進，以下是改進版RIPA裂解液配方：
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RIPA裂解液（配 1000 mL） |
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Tris |
6 g |
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NaCl（Sodium Chloride） |
8.76 g |
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脫氧膽酸鈉（Sodium Deoxycholate） |
5 g |
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SDS |
1 g |
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NaF（Sodium Fluoride） |
0.42 g |
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EDTA·2Na·2H?O |
1.86 g |
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Triton X-100 |
10 mL |
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鹽酸調pH至7.4，補ddH?O定容至1000mL，4℃保存。 |
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注：PMSF及其它蛋白酶抑制劑現用現加， 一般PMSF工作濃度1 mM，其他蛋白酶抑制劑根據產品說明書推薦濃度使用。 |
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除了可以根據目標蛋白的表達部位選擇不同的裂解液以獲得較好的提取效果以外（如膜蛋白或組蛋白），任何組分提取均可采用這款RIPA裂解液
2.凝膠制備相關試劑
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE，它有兩種形式：SDS-PAGE及Native-PAGE。
SDS-PAGE體系中有SDS，適用于變性蛋白，是最常用的一種PAGE,靶標電泳移率僅與分子量相關；Native-PAGE為非變性體系，主要用來分析活性蛋白及復合物，靶標電泳遷移率與分子量及電荷大小均相關。
▲ SDS-PAGE電泳示意圖
在SDS-PAGE中，凝膠對蛋白質的分離取決于凝膠所形成的孔徑大小，而凝膠孔徑大小與凝膠濃度相關（指分離膠濃度，即每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯劑的總克數稱凝膠濃度），故不同分子量的蛋白質選擇不同的凝膠濃度，分離效果會更好。
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分離膠濃度(％) |
線性分離范圍(kDa) |
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10+15(三層膠） |
4-40 |
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15 |
15-45 |
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12.5 |
15-60 |
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10 |
20-100 |
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8 |
30-200 |
▲ 不同分離膠的線性分離范圍
對于常規大于10kDa的蛋白，一般采用以下不同濃度的SDS-PAGE分離膠配方：
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分離膠（配 10 mL） |
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膠濃度 |
8% |
10% |
12% |
15% |
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ddH?O(mL) |
3 |
2.5 |
2 |
1.25 |
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40% 丙烯酰胺母液(mL) |
2 |
2.5 |
3 |
3.75 |
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2x 分離膠緩沖液(mL) |
5 |
5 |
5 |
5 |
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10% 過硫酸銨母液(mL) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
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TEMED(mL) |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
10%過硫酸銨母液（質量體積比10%）配好后需4℃冷藏，且建議在1周內使用。40%丙烯酰胺母液和2x分離膠緩沖液配方如下：
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40% 丙烯酰胺母液（32.3:1 ；配 1000 mL） |
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丙烯酰胺單體 |
388g |
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N',N'-甲叉雙丙烯酰胺 |
12g |
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充分攪拌溶解后，用ddH?O補足到1000mL，4℃避光保存。 |
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2x 分離膠緩沖液（配 1000 mL） |
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Tris-HCl(pH 8.8) |
90.8 g |
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SDS |
2.0 g |
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充分溶解后，用濃鹽酸將PH調到8.8，然后用ddH?O補足到1000mL。 |
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濃縮膠一般采用4%濃度的膠，以下為不同體積的SDS-PAGE濃縮膠配方：
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濃縮膠體積 |
4 mL |
6 mL |
8 mL |
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膠濃度 |
4% |
4% |
4% |
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ddH?O(mL) |
1.6 |
2.4 |
3.2 |
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40% 丙烯酰胺母液(mL) |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
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2x 濃縮膠緩沖液(mL) |
2 |
3 |
4 |
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10% 過硫酸銨母液(mL) |
0.04 |
0.06 |
0.08 |
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TEMED(mL) |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
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2x 濃縮膠緩沖液（配 1000 mL） |
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Tris |
30.3 g |
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SDS |
2.0 g |
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充分溶解后，用濃鹽酸將PH調到6.8，然后用ddH?O補足到1000mL。 |
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對于分子量小于10KDa的蛋白，建議使用Tris-Tricine膠(三層膠)體系。其中間隙膠可以阻擋一些大分子量的蛋白，從而使小分量的蛋白或肽段能夠在分離膠內得到更好的呈現。
▲ Tris-Tricine三層膠示意圖
Tris-Tricine-SDS-PAGE配方如下：
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濃縮膠 |
間隙膠 |
分離膠 |
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膠濃度 |
4 % |
10 % |
15 % |
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膠體積(mL) |
2 |
1.5 |
6 |
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37% 甘油(mL) |
— |
— |
1.63 |
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ddH?O(mL) |
1.51 |
0.595 |
— |
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40% 丙烯酰胺母液(mL) |
0.2 |
0.375 |
2.25 |
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3M Tris-HCl(pH 8.5)(mL) |
— |
0.5 |
2 |
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1M Tris-HCl(pH 6.8)(mL) |
0.25 |
— |
— |
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10% SDS(mL) |
0.02 |
0.015 |
0.06 |
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10% APS(mL) |
0.02 |
0.015 |
0.06 |
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TEMED(mL) |
0.002 |
0.0015 |
0.003 |
3.上樣及電泳相關試劑
進行電泳之前的蛋白樣本，我們還需要將其與上樣緩沖液（loading buffer）混合，該緩沖液中含SDS，使得蛋白變性并帶有相同電荷；含甘油，增加樣本密度便于樣本沉淀在加樣孔底部；含溴酚藍，指示跑膠時樣本的大概位置；含DTT，還原打斷蛋白中的二硫鍵。
4X SDS上樣緩沖液配方如下：
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4X SDS 上樣緩沖液（配 1000 mL） |
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1M Tris-HCl(pH 7.0)母液 |
150 mL |
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甘油 |
250 mL |
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SDS |
120 g |
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溴酚藍 |
0.4 g |
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用ddH?O補足體積到800mL, 分裝 -20℃保存。 |
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使用前按照4:1的體積比現加2M DTT溶液（或β-巰基乙醇）。 |
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蛋白與上樣緩沖液充分混勻后，95℃煮沸5分鐘，室溫冷卻后即可進行上樣。隨后開始電泳。
電泳前我們需要準備好電泳緩沖液。常規SDS-PAGE采用的是Tris-Gly系統電泳緩沖液，配方如下：
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1x Tris-Gly電泳緩沖液(配 1000 mL) |
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Tris |
3.03 g |
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甘氨酸 |
18.75 g |
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SDS |
1 g |
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充分溶解后，用ddH?O將體積補足到1000mL。 |
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對于Tris-Tricine-SDS-PAGE采用的是Tris-Tricine系統電泳緩沖液，該緩沖液分為Tris-Tricine陰極電泳緩沖液和Tris-Tricine陽極電泳緩沖液，具體配方如下：
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1x Tris-Tricine陰極電泳緩沖液(配 1000 mL) |
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Tris |
12.1 g |
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Tricine |
17.9 g |
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SDS |
1 g |
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充分溶解后，用超純水將體積補足到1000mL。 |
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1x Tris-Tricine陽極電泳緩沖液(配 1000 mL) |
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Tris |
24.23 g |
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充分溶解后，用濃鹽酸將PH調到8.9，然后用ddH?O將體積補足到1000mL。 |
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4.轉膜及孵育相關試劑
電泳完成后，需要將膠上的蛋白轉移到膜上面。需要用到轉膜緩沖液。根據轉膜方式不同，轉膜緩沖液配方也有一定變化，以下是兩種常用轉膜緩沖液配方：
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濕轉緩沖液（配 1000 mL） |
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Tris |
2.9 g |
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甘氨酸 |
14.5 g |
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乙醇 |
200 mL |
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充分溶解后，用ddH?O將體積補足到1000mL。 |
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半干轉緩沖液(用于Tris-Tricine膠轉移)(配 1000 mL) |
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Tris |
36.3 g |
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醋酸 |
6 mL |
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甲醇 |
200 mL |
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充分溶解后，用ddH?O將體積補足到1000mL。 |
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轉膜完成之后，我們即可進行封閉和抗體孵育過程，這個過程中用量比較大的試劑是1X TBST洗滌液，其配方如下：
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1X TBST洗滌液（配 1000 mL） |
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Tris |
2.42 g |
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NaCl |
8.76 g |
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KCl |
0.373 g |
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Tween-20 |
2 mL |
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用濃鹽酸將PH調到7.4，用ddH?O將體積補足到1000mL。 |
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轉膜結束后，即可進行顯色操作。目前一般采用增強化學發光（ECL），酶促底物DAB顯色和熒光二抗顯影三種方法進行顯色，這些步驟都需要配套的商業化產品進行操作。
客服一