DAF-FM DA(NO 熒光探針)

產(chǎn)品編號(hào)                產(chǎn)品名稱(chēng)                                       規(guī)格
FA3251           DAF-FM DA(NO 熒光探針)                     100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
DAF-FM DA 即 4-Amino-5-Methylamino-2,7-Difluorofluorescein Diacetate，也稱(chēng)DAF-FM Diacetate，是用于一氧化氮（nitric oxide, NO）定量檢測(cè)的探針，其檢測(cè)原理為：DAF-FM DA 可以穿過(guò)活細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后可以被胞漿內(nèi)的酯酶催化形成不能穿過(guò)細(xì)胞膜的 DAF-FM，DAF-FM 本身僅有很弱的熒光，但在與 NO 反應(yīng)后會(huì)生成熒光素-苯駢三氮唑（benzotriazole），可以產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光。熒光顯微鏡、激光共聚 焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀都可以用于該熒光探針的檢測(cè)。
DAF-FM DA 新一代 NO 檢測(cè)探針，與以往的一氧化氮熒光檢測(cè)探針 DAF-2 DA 相比較，主要有以下優(yōu)勢(shì)：一是 DAF-FM DA 和 NO 反應(yīng)形成的熒光產(chǎn)物在 pH5.5 以上不受 pH 影響；二是反應(yīng)產(chǎn)物熒光更加穩(wěn)定，不容易淬滅，更加便于檢測(cè)；三是 DAF-
FM DA 的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到 3nM，與 DAF-2 DA 相比最低檢測(cè)濃度提高近 2 倍。本 DAF-FM DA 為溶解于 DMSO 的淡黃色溶液，濃度為 5mM。通常至少可以檢
測(cè) 100 個(gè)樣品。

包裝清單：
1 DAF-FM DA(NO 熒光探針) 20μl
2 DAF-FM DA(NO 熒光探針)稀釋液 50ml
3 說(shuō)明書(shū) 1 份

保存條件：
-20℃保存，DAF-FM DA 需避光保存，1 年有效。

使用說(shuō)明：
1.裝載探針
對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為 2 小時(shí)以?xún)?nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用適當(dāng)?shù)年?yáng)性
對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)（通常為 6 小時(shí)以上）的細(xì)胞，先用適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照 1:1000 比例，用本試劑盒提供的DAF-FM DA 稀釋液稀釋 DAF-FM DA，使終濃度為 5μM/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的 DAF-FM DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的 DAF-FM DA 的體積為 1mL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 20 分鐘。用 PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DAF-FM DA。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照 1:1000 比例，用本試劑盒提供的 DAF-FM DA 稀釋液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為 5μM/L。細(xì)胞收集后，用稀釋好的 DAF-FM DA 重懸細(xì)胞， 細(xì)胞濃度為 1×106～2×107cell/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 20 分鐘。上述操作可以在離心管內(nèi)進(jìn)行。每隔 3-5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用 PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DAF-FM DA。直接用適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后再刺激細(xì)胞。
2.檢測(cè)
對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察（用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對(duì)較差），或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3.參數(shù)設(shè)置
使用 495nm 激發(fā)波長(zhǎng)，515nm 發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DAF-FM 和一氧化氮反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜和fluorescein 非常相似， 可以用檢測(cè)fluorescein 的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，用檢測(cè) FITC 的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)也可以。
4.其它說(shuō)明
上述推薦的 DAF-FM DA 的工作濃度為 5μM/L，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照 1:2000-1:5000 的比例稀釋 DAF-FM DA， 使裝載探針時(shí) DAF-FM DA 的濃度為 1-2.5μM/L。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把 DAF-FM DA 的工作濃度為調(diào)整為 10μM/L，以提高檢測(cè)的靈敏度。另外，探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在 15-60 分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。


注意事項(xiàng)：
1、BSA 和酚紅對(duì)該熒光探針的檢測(cè)有干擾，需避免。
2、第一次使用前請(qǐng)將本品分裝并于-20℃凍存，避免反復(fù)凍存；熒光探針工作液需立刻使用，不能長(zhǎng)時(shí)間保存。
3、DAF-FM DA 在 4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20-25℃溫浴片刻至全部融解后使用。
4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。